PRACTICA No. 6: "RECUENTO DE PLAQUETAS CON CÁMARA DE NEUBAUER"

CUENTA DE PLAQUETAS CON CÁMARA DE NEUBAUER

OBJETIVO

Realizar  e interpretar la técnica para la cuenta de trombocitos o plaquetas en la cámara de Neubauer.

FUNDAMENTO

Los trombocitos o plaquetas constituyen una parte esencial del organismo hemostático del cuerpo. Son cuerpecillos hialinos incoloros que miden de 2-4 μ, de bordes irregulares, pero pueden tener forma esférica u ovalada, carecen de núcleo y son muy frágiles. Provienen de una célula gigante que mide de entre 50-100 μ de diámetro llamada megacariocito.

Una de las principales funciones de las plaquetas es participar en los mecanismos de la hemostasia (Hemos=sangre, stasis=detención) adhiriéndose entre ellas y a las paredes de los vasos sanguíneos lesionados, para formar así el trombo plaquetario o tapón hemostático.

El líquido diluyente puede ser una solución estéril de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo (85 milimolar) y cloruro de sodio (31 milimolar). Este líquido se provee listo para usar y su conservación es indefinida en refrigerador (2 - 10° C) o puede ser también oxalato de amonio al 1%. El fundamento del método consiste en la producción de hemólisis por la utilización de un líquido hipotónico, y el mantenimiento de las plaquetas intactas y sin agrumar por la presencia de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo.

MATERIAL

v  Pipeta de Thoma para glóbulos rojos (perla roja)

v  Equipo para venopuncion (Tubo lila)

v  Boquilla roja

v  Tubo de goma

v  Tubos de ensayo

v  Papel parafilm

v  Cámara de Neubauer

v  Cubrehematimetro

v  Microscopio

v  Gasas

v  Caja de Petri

v  Papel filtro

SUSTANCIAS

Ø  Alcohol al 70%

Ø  Sangre venosa

Ø   Diluyente de plaquetas

PROCEDIMIENTO

1.    Obtener 10 ml de sangre venosa, en un tubo con anticoagulante EDTA

2.    Agitar la sangre de manera suave en el tubo para mezclarla con el anticoagulante

3.    Llevar la sangre hasta la marca 1.0 de la pipeta de Thoma. Limpiar la punta con una gasa

4.    Aforar con liquido diluyente de plaquetas hasta la marca 101 de la pipeta (Dilución 1:100)

5.    Tapar los extremos con papel parafilm y mezclar durante 1 minuto

6.    Colocar la Cámara de Neubauer sobre una superficie horizontal y poner el cubrehematímetro sobre las mesetas

7.    Descartar las primeras 4 gotas de la pipeta. Con la quinta gota cargar la cámara, depositándola entre la meseta y el cubrehematímetro y dejarla difundir por capilaridad, teniendo cuidado de que no se formen burbujas o se derrame el líquido hacia los surcos

8.    Colocar la cámara de Neubauer  ya cargada en el interior de una caja de Petri, con papel filtro humedecido en agua para evitar la evaporación, dejar en reposo de 10 a 15 minutos

9.    Observar al microscopio contando en la cuadricula central (para glóbulos  rojos) las plaquetas  que aparecen mucho más pequeñas que los hematíes, redondas, alargadas u ovales, altamente refringentes

10. El cuadro central de la cuadricula mide 1.0 mm por lado y está dividido en 16 cuadritos más pequeños, de tal manera que el número total de estos últimos es de 400, mismos en los que se lleva a cabo el recuento de plaquetas.

OBSERVACIONES

Cámara de Neubauer, 10x

Enfocando la cuadricula central se aprecian los 25 cuadros centrales, con una gran cantidad de plaquetas en ellos. Se pueden distinguir solo algunos eritrocitos, mucho mayores que las plaquetas, que desprenden gran brillo

Cámara de Neubauer, 40x

Uno de los cuadros centrales, lleno de plaquetas, de forma redonda la mayoría u ovalada.

RESULTADOS

Los recuentos de plaquetas, al igual que los eritrocitos y leucocitos,  se expresan como concentraciones, que en este caso serían número de células por unidad de volumen de sangre, que es 1mm³
Después de contar las plaquetas presentes en los 400 cuadritos centrales, el número obtenido se multiplica por el factor de dilución  de la siguiente manera:
N° de plaquetas x mm³ = No. De plaquetas contadas X dilución X 10
Dilución: 1:100
Este factor corresponde, para obtener los resultados por mm³ ya que el volumen de la cámara es de 0.1 mm³
El número de plaquetas fue de 535, por lo que al realizar los cálculos quedaron así:
No. de plaquetas = 535 X 100 X 10= 535 000 plaquetas por mm³, lo que indica un índice elevado de plaquetas.

VALORES DE REFERENCIA

(Millones de células/mm3)

Hombres y Mujeres:………………………………..150 000 - 450 000

 CONCLUSIÓN

El recuento de plaquetas es de suma importancia y es parte del recuento celular de la sangre como prueba de rutina.

El paciente con un trastorno hemorrágico, clínicamente significativo, acude al médico con algunos tipos de síntomas hemorrágicos, con lo que se puede indicar la parte defectuosa del mecanismo de coagulación, y dentro de estas causas pueden estar la cantidad inadecuada de plaquetas.

La hemorragia de vasos sanguíneos subcutáneos  en piel intacta se puede ver como petequias o equimosis. Cuando se encuentran  equimosis en gran cantidad y sin traumatismo aparente, el trastorno se conoce como Diátesis Hemorrágica y puede ser producida por anormalidades en los vasos sanguíneos, por la disminución en el número de plaquetas o por el mal funcionamiento.

La disminución de plaquetas se denomina Trombopenia o púrpura trombocitopénica y se debe a lo siguiente:

·         Enfermedades autoinmunitarias (el organismo produce anticuerpos contra sus propias plaquetas)

·         Aplasia medular
·         Radioterapia y quimioterapia por cáncer
·         Leucemia aguda
·         Coagulación intravascular diseminada
·         Anemia hemolítica microangiopática
·         Hiperesplenismo
·         Púrpura trombocitopénica idiopática
·         Prótesis de válvula coronaria
·         Transfusión de sangre
·         Choque anafiláctico
·         Algunas infecciones víricas
·         Algunos fármacos

Y el aumento se denomina trombocitosis:

·         Anemia por déficit de hierro

·         Traumatismos
·         Tumores
·         Trombocitosis esencial
·         Policitemia vera
·         Leucemia mieloide crónica
·         Tras esplenectomía
·         Enfermedad de Kawasaki

Bibliografía:

·      Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos, articulo web consultado el día 8 de marzo de 2012 en: http://html.rincondelvago.com/fundamentos-y-tecnicas-de-analisis-hematologicos-y-citologicos.html

·         Recuento de plaquetas, artículo consultado el día 23 de marzo en http://www.americalab.net/acerca-de-las-pruebas/recuento-de-plaquetas.html

·         Martínez Fragoso, Vicente. Manual de Biometría Hemática. CBTis199, México, 2012. Pp. 30-32

PRACTICA No.5: "RECUENTO DE LEUCOCITOS"

CUENTA DE LEUCOCITOS

OBJETIVO

Aprender a realizar y aplicar la metodología para un recuento de Leucocitos por milímetro cúbico de sangre e interpretar el resultado.

FUNDAMENTO

Para el conteo de leucocitos, se usan métodos sistemáticos que son más rápidos y precisos, y los métodos manuales.

Todo método manual de recuento celular incluye 3 fases:

ü  Dilución de la sangre

ü  Muestreo de la sangre diluida en un volumen

ü  Recuento de células en ese volumen

Para el recuento de leucos se cuentan los 4 cuadrados de las esquinas, que corresponden a los  campos 1, 3,7 y 9.

Para su dilución, se hace lo mismo que para los hematíes pero empleando la pipeta de blancos, de modo que la solución que obtenemos es de 1/20. Se utiliza como diluyente el líquido de Turk. El líquido de Turk es hipotónico de modo que se destruyen los hematíes y así no entorpecen en el recuento.

El líquido de Turk consta de ácido acético glaciar 2ml, violeta de genciana disolución de 1% 1ml y agua destilada en cantidad suficiente para 1000ml. Deberá filtrarse a menudo para evitar levaduras y hongos.

En un principio es un poco difícil distinguir los leucocitos de los restos de membranas de los hematíes hemolizados. Se debe tener en cuenta que los leucocitos son más refringentes (más brillantes) al moverlo con el microscopio que los restos de hematíes. Se debe observar la presencia de la membrana citoplasmática y de la membrana nuclear (a veces más) como líneas finas y brillantes. Esto se observa fácilmente moviendo el microscopio hacia delante y hacia atrás

MATERIAL

v  Pipeta de Thoma para glóbulos blancos (perla blanca)

v  Equipo para venopuncion (Tubo lila)

v  Boquilla blanca

v  Tubo de goma

v  Tubos de ensayo

v  Papel parafilm

v  Cámara de Neubauer

v  Cubrehematimetro

v  Microscopio

v  Gasas

SUSTANCIAS

Ø  Alcohol al 70%  

Ø  Sangre venosa

Ø  Liquido de Turk 

PROCEDIMIENTO

1.    Una vez seleccionada, se desinfecta la zona con alcohol al 70%, y se practica punción venosa. La sangre es recogida en un tubo lila con EDTA

2.    Colocar el tubo de plástico y la boquilla para aspirar en la pipeta

3.    Llenar la pipeta de glóbulos blancos con sangre hasta la marca 0.5 para realizar una dilución de 1/20. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. Si la sangre se pasa de la marca, se puede absorber con gasa el excedente

4.    Introducir la pipeta en el tubo o frasquito que contiene el diluyente (liquido de Turk) y absorber hasta la marca 11, no deben quedar burbujas.

5.    Se tapan ambos extremos de la pipeta con papel parafilm y se coloca en un rotador automático o se hace rotar manualmente de 2-3 minutos

6.    Montar la laminilla de vidrio en la cámara para recuento. Debe estar limpia y seca.

7.    Destapar la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequeña cerca de un extremo de la cámara para que por capilaridad se llene exactamente.

8.    Dejar 3 minutos  que los leucocitos se sedimenten

9.    Colocar en la platina del microscopio y enfocar la cuadricula a 10x. y contar  en los 4 cuadrados angulares.

10. En el recuento se incluyen las células que cubren o tocan por dentro o por fuera las líneas limitantes superior e izquierda en el cuadro pequeño de recuento y no se consideran los que estén en los límites inferior y derecho.

OBSERVACIONES

Cámara de Neubauer, 40x

Enfocando uno de los cuadros laterales, se aprecian claramente los 16 cuadros pequeños donde se tienen que contar los leucocitos que hay en ellos. Se debe de tener cuidado de no confundir los restos de eritrocitos hemolizados con los leucocitos, que deben de aparecer como puntos purpuras o negros, como los que están a las 9

RESULTADOS

Los recuentos de leucocitos, al igual que los eritrocitos,  se expresan como concentraciones, que en este caso serían número de células por unidad de volumen de sangre, que es 1mm³

Después de contar los glóbulos blancos de los 4 cuadrados angulares, se suman el total de ellos y con dicha cantidad de hace el siguiente cálculo:

N° de leucocitos x mm³ = altura x dilución x área 

N° de leucocitos x mm³ = 1/10 x 1/20 x 4 = 1/10 000

N° de leucocitos x mm³ = 4/200 = 1/50

N° de leucocitos x mm³ = N° de leucocitos contados x 50

En el análisis hecho,  los resultados de la cuenta de células quedaron así por casilla:

El número de leucocitos fue de 111, que al multiplicarse por 50 daba como resultado    5 550/mm³, lo que indica un índice normal, sin embargo apenas y supera el mínimo, pues el paciente era un hombre, de 41 años de edad.

VALORES DE REFERENCIA

(Millones de células/mm3)

Hombres y Mujeres:………………………………..5 000-10 000

CONCLUSIÓN

Los leucocitos son las células sanguíneas que dentro del organismo participan desarrollando diferentes funciones como son: fagocitosis, defensa inmunológica específica o inespecífica.

Existen dos grandes tipos de estos glóbulos:

Polimorfonucleares:

·         Basófilos

·         Eosinófilos

·         Neutrófilos

Mononucleares:

·         Linfocitos (células T y células B)

·         Monocitos

El recuento leucocitario representa el número de leucocitos en un litro  de sangre completa. La cuantificación o recuento de leucocitos es muy importante para el diagnóstico de enfermedades.

Un bajo número de glóbulos blancos se denomina leucopenia y puede deberse a:

·         Insuficiencia de la médula ósea (por ejemplo: debido a infección, tumor o cicatrización anormal).

·         Enfermedades vasculares del colágeno (como el lupus eritematoso sistémico).

·         Enfermedad del hígado o el bazo.

·         Radioterapia o exposición a la radiación.

Un alto número de glóbulos blancos se denomina leucocitosis y puede deberse a:

• Anemia.
• Tumores de la médula ósea.
• Enfermedades infecciosas.
• Enfermedad inflamatoria (como artritis reumatoide o alergia).
• Leucemia.
• Estrés emocional o físico intensos.
• Daño tisular (por ejemplo, quemaduras).

Es muy importante comentarle al médico acerca de cualquier medicamento que se esté tomando, incluyendo productos de venta libre. Ciertos fármacos pueden interferir con los resultados del examen, como Sulfonamidas, Alopurinol, Ácido acetilsalicílico (aspirina), cloroformo, corticosteroides, epinefrina, heparina, quinina o triamtereno

La cámara de Neubauer o hemocitómetro es una lámina portaobjeto gruesa, en cuyo centro se hayan dos superficies cuadriculadas iguales, separadas del resto de la lámina por surcos y dos barras transversales algo más elevadas.

Una laminilla cubreobjetos ópticamente plan, que al colocarse sobre las barras elevadas de la lámina forma una cámara entre el cubreobjetos y la superficie cuadriculada, teniendo una altura de 0.1mm

En la cámara de Neubauer las áreas de recuento de eritrocitos y leucocitos son diferentes, como se muestra en la imagen.

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Bibliografía:

•     Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos, articulo web consultado el día 8 de marzo de 2012 en: http://html.rincondelvago.com/fundamentos-y-tecnicas-de-analisis-hematologicos-y-citologicos.html

·         Conteo de glóbulos blancos, artículo consultado el día 16 de marzo en http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003643.htm

• Martínez Fragoso, Vicente. Manual de Biometría Hemática. CBTis199, México, 2012. Pp. 22-24

   

PRÁCTICA No. 4: "CUENTA DE ERITROCITOS"

CUENTA DE ERITROCITOS

OBJETIVO

Aprender a realizar un recuento de Eritrocitos por milímetro cúbico de sangre, interpretar el resultado, así como adiestrarse en el manejo de la cámara de Neubauer y la pipeta de Thoma

FUNDAMENTO

Para el conteo de eritrocitos, se usan métodos sistemáticos que son más rápidos y precisos, y los métodos manuales.

Todo método manual de recuento celular incluye 3 fases:

ü  Dilución de la sangre

ü  Muestreo de la sangre diluida en un volumen

ü  Recuento de células en ese volumen

Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son viables.
Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que utiliza la cámara de Neubauer

Para el conteo de eritrocitos, es necesario diluir la sangre con el líquido de Hayem, en una proporción exacta. Luego se examina en el microscopio con una cantidad pequeña colocada en la cámara de Neubauer, contando el número de elementos que se encuentran en el retículo de la cámara y mediante una operación se obtiene el número total.

Para la realización del conteo manual se necesita un líquido de dilución, una cámara de recuento, una pipeta diluidora y un microscopio.

MATERIAL

v  Pipeta de Thoma para glóbulos rojos (perla roja)

v  Equipo para venopuncion (Tubo lila)

v  Boquilla roja

v  Tubo de plástico

v  Tubos de ensayo

v  Papel parafin

v  Cámara de Neubauer

v  Cubrehematimetro

v  Microscopio

v  Gasas

SUSTANCIAS

Ø  Alcohol al 70%

Ø  Sangre venosa

Ø  Liquido de Hayem 

PROCEDIMIENTO

1.    Una vez seleccionada, se desinfecta la zona con alcohol al 70%, y se practica punción venosa. La sangre es recogida en un tubo lila con EDTA

2.    Colocar el tubo de plástico y la boquilla para aspirar en la pipeta

3.    Llenar la pipeta de glóbulos rojos con sangre hasta la marca 0.5 para realizar una dilución de 1/200, y si se carga hasta 1, la dilución será 1/100. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. Si la sangre se pasa de la marca, se puede absorber con gasa el excedente

4.    Introducir la pipeta en el tubo o frasquito que contiene el diluyente (Hayem) y llenar de líquido de dilución hasta la marca de 101

5.    Se tapa la punta con papel parafin y se coloca en un rotador automático o se hace rotar manualmente de 2-3 minutos

6.    Destapar la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequeña cerca de un extremo de la cámara para que por capilaridad se llene exactamente. Dejar 2 minutos  que los eritrocitos se sedimenten

7.    Colocar en la platina del microscopio y enfocar la cuadricula a 10x. luego con el objetivo de 40x contar sobre el cuadro grande central de la cámara solo en 5 cuadrados pequeños: uno central y cuatro angulares (80 cuadritos del total)

8.    En el recuento se incluyen las células que cubren o tocan por dentro o por fuera las líneas limitantes superior e izquierda en el cuadro pequeño de recuento y no se consideran los que estén en los límites inferior y derecho.  

OBSERVACIONES

Cámara de Neubauer, 10x

El rayado de la cámara de Neubauer cubierta de miles de eritrocitos, que destacan por su forma redonda y gran cantidad.

Cámara de Neubauer, 40x

Enfocando el cuadro central de los cuadros pequeños, se aprecian claramente los 16 cuadritos pequeños donde se tienen que contar los eritrocitos que hay en ellos.

RESULTADOS

Los recuentos de eritrocitos  se expresan como concentraciones, que en este caso serían número de células por unidad de volumen de sangre, que es 1mm³

Después de contar los hematíes de los 5 cuadrados pequeños, se suman y con dicha cantidad de hace el siguiente cálculo:

N° de hematíes x mm³ = altura x dilución x área  

N° de hematíes x mm³ = 1/10 x 1/200 x 1/5 = 1/10 000

N° de hematíes x mm³ = hematíes contados x 10 000

En el análisis hecho, el número de eritrocitos fue de 491, que al multiplicarse por 10 000 daba como resultado 4 910 000/mm³, lo que indica un índice normal pues el paciente era una mujer de 11 años de edad.

VALORES DE REFERENCIA

(Millones de células/mm3)

Hombres:………………………………..4 500 000-5 500 000

Mujeres:…………………………...…….4 000 000-5 000 000

Niños (4 años):……….........................4 200 000-5 200 000

Lactantes (1-6 meses):....…………….3 800 000-5 200 000

Recién nacidos:………………………..5 000 000-6 000 000

CONCLUSIÓN

Los eritrocitos o glóbulos rojos son células de color amarillento, con la forma  de un disco bicóncavo, sin núcleo y contienen un pigmento llamado hemoglobina que les otorga su característico color.

Estos se forman constantemente en la medula ósea, en el cráneo, las costillas, las vértebras y el esternón, en un proceso conocido como eritropoyesis. Viven aproximadamente 120 días y al envejecer son destruidos por las células reticuloendoteliales del  hígado, la medula ósea y el bazo.

La falta de núcleo le confiere la virtud de acarrear oxigeno sin consumir nada de él.  

La pipeta de Thoma para glóbulos rojos está constituida por dos porciones capilares y un bulbo central. El tubo capilar inferior está dividido en 10 partes iguales con marcas de 0.5 y 1.0. En el interior del bulbo existe una perlita de plástico roja para favorecer la mezcla de sangre con el líquido y en el capilar superior hay una marca de 101.

El líquido de dilución no solamente debe de diluir los eritrocitos hasta cifras legibles, sino que también permita identificarlos y que destruya otros elementos celulares que no son de interés en este momento. En general se puede usar cualquier solución isotónica como diluyente y pueden ser:

Y  Soluciones de Gower

Y  Soluciones de Dace

Y  Solución salina de NaCl al 0.9%

Y  Liquido de Hayem, el cual está formado de 5g de NaCl, 2.5g de Na₂SO₄, 2.5g de MgCl₂ y agua destilada para un litro. Este último es el más usado.

Es muy importante observar que en la cámara de Neubauer las áreas de recuento de eritrocitos y linfocitos son diferentes.

Los glóbulos rojos se cuentan en las áreas coloreadas de rojo, mientras que los glóbulos blancos se cuentan en las áreas coloreadas de azul. 

Para realizar el conteo se enfoca con el objetivo 40x, y se localiza el cuadro central con el condensador bajo y luz débil.

Para proceder al recuento, que se lleva a cabo en los cuadrados pequeños del retículo marcado en color rojo, contando las células en cada cuadro, en barrido o fila.

Bibliografía:

• Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos, articulo web consultado el día 8 de marzo de 2012 en: http://html.rincondelvago.com/fundamentos-y-tecnicas-de-analisis-hematologicos-y-citologicos.html
• Cámara de Neubauer, consultado el día 15 de abril de 2011 en http://2l2m-laboratoristaclinico.blogspot.com/2009/04/camara-de-neubauer.html
• Martínez Fragoso, Vicente. Manual de Biometría Hemática. CBTis199, México, 2012. Pp. 9-11