PRACTICA No. 5 "METODO DE CONCENTRACION POR SEDIMENTACION RITCHIE"

COPROPARASITOSCÓPICO: MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR SEDIMENTACIÓN RITCHIE

Esta práctica se llevó a cabo el día jueves 15 de septiembre 2011, en las instalaciones del laboratorio para prácticas de análisis clínicos del CBTis 199, como parte del programa de 3º semestre para la preparación de la carrera de Laboratorista Clínico, en su subdivisión de técnicas parasitológicas.

OBJETIVO

Aprender a realizar la técnica por sedimentación de Ritchie, para la búsqueda de quistes y huevos que puedan quedar sedimentados.

FUNDAMENTO

Existen dos procedimientos principales en las heces para su análisis: flotación y sedimentación.

La sedimentación es menos eficaz que la flotación para la concentración de quistes de protozoarios y abundantes huevos, pero es más útil para la búsqueda de huevos de esquistosoma y operculados.

El método de Ritchie o también llamado método de concentración en éter-formalina es una técnica de sedimentación que se basa en la concentración de huevos de helmintos, larvas y quistes de protozoarios mediante la centrifugación, con la ayuda de formol y éter para separar y visualizar los elementos parasitarios.

Entre las muchas ventajas que tiene este procedimiento están: 
1. Reune  y no deforma las posibles formas parasitarias
2. Permite que se pueda transportar y almacenar la materia fecal procesada antes de ser examinada, pues los agentes quimicos conservan a los parasitos que existan en la muestra
3. Se usa cuando necesitan una técnica para evaluación de tratamiento y determinación de frecuencia.

    

MATERIAL: v  Tubos de ensaye cónicos de 15 ml v  Embudo de cristal v  Vaso de precipitados 50 ml v  Gasa cortada en cuadro v  Aplicadores de madera v  Abatelenguas v  Pipetas Pasteur con bulbo v  Portaobjetos v  Cubreobjetos v  Gradilla v  Centrifuga v  Microscopio                                                              SUSTANCIAS: Ø  Solución salina isotónica Ø  Solución de formaldehído al 10% Ø  Éter etílico Ø  Solución de yodo-lugol Ø  Muestra biológica: heces fecales frescas PROCEDIMIENTO 1.    Tomar con el abatelenguas aproximadamente 1 gr de materia fecal y colocar en el vaso de precipitados, añadir 10 ml de solución salina y homogeneizar 2.    Se filtra la suspensión a través de la gasa doblada en cuatro partes y colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico.       3.    Centrifugar el filtrado a 2000 rpm por 2 minutos 4.    Decantar el líquido sobrenadante y resuspender con el aplicador de madera el sedimento con solución salina. Centrifugar nuevamente, decantar y resuspender dos veces más. 5.    Al último sedimento se agregan 5 ml de solución de formaldehído al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 minutos en la gradilla 6.    Se añaden 0.5 ml de éter, se tapan los tubos y se agitan enérgicamente durante 30 segundos. 7.    Centrifugar durante 2 minutos a 2000 rpm 8.    Después de centrifugar se observan cuatro capas (se hablara de ellas mas adelante) 9.    Decantar el sobrenadante 10. Introducir la pipeta Pasteur hasta el sedimento, extraer con cuidado una gota del sedimento y colocarla en el portaobjetos 11. Añadir una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos homogeneizar, y cubrir con el mismo 12. Observar la preparación con al microscopio con objetivos 10x y 40x. OBSERVACIONES  Frotis, 10x Se distingue a la 1 un pequeño punto que corresponde a un quiste de Entamoeba histolytica, pues tenía 4 núcleos. Frotis, 10x Se distinguen en este par de imágenes muchos restos vegetales, grasas y algunos quistes dispersos, que presentaban numerosos núcleos, de 5 – 8, pertenecientes a Entamoeba coli. También hay una gran número de bacterias. Frotis, 40x Sobresale a las 4 un residuo vegetal, pero nótese al centro una estructura amorfa, pero delimitada. Posee en centro una zona más iluminada y un círculo en su interior. No se sabe realmente, pero es posible que sea un trofozoíto de Entamoeba histolytica Frotis, 40x A las 8 se observa una fibra muscular parcialmente digerida  RESULTADOS Y CONCLUSIONES  Como puede verse, el resultado para huevecillos de parásitos resulto negativo. Sin  embargo se encontraron una gran cantidad de quistes de Entamoeba coli, y al menos 3 de Entamoeba histolytica. Esto significa que la persona probablemente se enferme seguido del estómago, pero no tan grave como para presentar síntomas de amibiasis. Cabe recordar que la Entamoeba  coli vive como comensal en el ser humano, pero últimamente se han registrado algunos casos de amibiasis  causada por ella. En cuanto a la Entamoeba histolytica, en la proporción encontrada puede no ser dañina, pues se necesitan encontrar al menos de 8-10 quistes por campo para que cause problemas, aunque no hay que olvidar que se puede padecer amibiasis asintomática.   También se encontraron fibras de tejido muscular semidigeridas, restos de comida y algunas grasas. Como puede verse, el resultado para huevecillos de parásitos resulto negativo. Sin embargo se encontraron una gran cantidad de quistes de Entamoeba coli, y al menos 3 de Entamoeba histolytica. Esto significa que la persona probablemente se enferme seguido del estómago, pero no tan grave como para presentar síntomas de amibiasis. Cabe recordar que la Entamoeba  coli vive como comensal en el ser humano, pero últimamente se han registrado algunos casos de amibiasis  causada por ella. En cuanto a la Entamoeba histolytica, en la proporción encontrada puede no ser dañina, pues se necesitan encontrar al menos de 8-10 quistes por campo para que cause problemas, aunque no hay que olvidar que se puede padecer amibiasis asintomática.  También se encontraron fibras de tejido muscular semidiegridas, restos de comida y algunas grasas. Las técnicas de flotación, sedimentación y conteo son algunas de los métodos que se utilizan en los laboratorios de rutina para la búsqueda de parásitos intestinales como parte del diagnóstico de protozoarios, trematodos, cestodos, nematodos y ocasionalmente, algunos artrópodos.  El método de Ritchie es uno de ellos, y se basa en el principio de la densidad. Usa sustancias químicas, como lo son el formaldehído y el éter, que permiten remover material lípido y coloidal y obtener así un sedimento más “puro”. Además, la formaleina conserva huevos, larvas y quistes, por lo que el material puede examinarse horas o incluso días después.  La finalidad de repetir el proceso de centrifugación con solución salina, es porque de esa manera también se elimina la mayor cantidad de restos fecales, vegetales y grasas que estén presentes, que intervienen la mayoría de las veces en la visualización microscópica.  La función de la centrifuga en esta práctica fue de suma importancia, puesto que utiliza la fuerza centrípeta para separar sustancias de diferentes densidades. Al centrifugar la mezcla del sedimento con el formol y el éter se menciona la presencia de 4 capas, las cuales son: 1.    Éter en la superficie 2.    Un tapón de restos fecales y grasos 3.    Formaldehído 4.    Sedimento en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios.  La concentración por centrifugación, sea con agua o agentes químicos, es más eficaz que la sedimentación simple.  En México, se ha empleado la técnica de Ritchie como complemento del examen directo, pero no todos los laboratorios la realizan, porque éter que se usa como reactivo se adquiere de importación y no está al alcance de nuestras instituciones de salud. Por tal motivo, algunos de los laboratorios de investigación están haciendo pruebas experimentales que puedan sustituir al éter por la nafta, más barata y de producción nacional. Sería bueno que nosotros como estudiantes también pudiéramos hacer la prueba con nafta  para comprobar como son los resultados en el diagnóstico de protozoos y poder comparar con el método tradicional. Fuentes consultadas: ·         Manual de laboratorio de parasitología, documento formato pdf, consultado el día 15 de septiembre en http://es.scribd.com/doc/5275620/MANUAL-DE-LABORATORIO-DE-PARASITOLOGIA ·         Brown, H. W. Parasitología Clínica Edit. Interamericana. México, 1985. Pp. 337-338 ·         Técnicas coproparasitoscópicas, consultado el día 15 de septiembre 2011 en http://html.rincondelvago.com/parasitologia_5.html