PRACTICA No. 7: "TÉCNICAS DE CUENTA DE HUEVOS EN HECES: TÉCNICA DE STOLL"

TÉCNICAS DE CUENTA DE HUEVOS EN HECES: TÉCNICA DE STOLL

Esta práctica se llevó a cabo el día jueves 29 de septiembre 2011, en las instalaciones del laboratorio para prácticas de análisis clínicos del CBTis 199, como parte del programa de 3º semestre para la preparación de la carrera de Laboratorista Clínico, en su subdivisión de técnicas parasitológicas.

OBJETIVO

 Aprender a realizar la técnica cuantitativa de Stoll para el conteo y cálculo de la cantidad de huevecillos de helmintos.

FUNDAMENTO

En un examen coproparasitoscópico, es de gran utilidad la identificación de los parásitos que pudieran existir en la muestra de heces fecales, pero más importante aún es poder establecer en qué cantidad está el parasito y determinar de esta manera la intensidad de la infestación.

Por lo general, la sintomatología de las enfermedades parasitarias se correlaciona con el número de parásitos presentes. Para esto, es de gran utilidad conocer la eliminación diaria de huevecillos de varias especies de helmintos, y la forma de los quistes de los diversos protozoos que se pueden encontrar en el tracto digestivo.

Por tanto, se hace una estimación del número de parásitos al contar el número de huevos en una cantidad conocida de heces y al calcular el número de gusanos que se requieren para producir dicho número.

Los mejores resultados se logran cuando las cuentas se realizan en muestras sucesivas obtenidas en un periodo de varios días, de manera que se pueda determinar el promedio diario de liberación de huevos.

Uno de los métodos más usados es el de Stoll.  Este se basa en los principios de saponificación, homogenización y aclaración. El NaOH 0.1 N al ponerse en contacto con las grasas de las heces se saponifica, hace que los huevos de los parásitos sean menos pegajosos, desinfecta y desodoriza la muestra

MATERIAL: v  Tubos de ensaye cónicos de 15 ml v  Aplicadores de madera v  Perlas de vidrio v  Portaobjetos v  Cubreobjetos v  Microscopio   SUSTANCIAS: Ø  Solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0.1 N Ø  Muestra biológica: heces fecales frescas

 PROCEDIMIENTO

1.    Se llena una probeta graduada de 100 ml con 56 ml de hidróxido de sodio 0.1 N.

En esta práctica, para fines didácticos, se usara en lugar de probeta un tubo de plástico cónico de 15 ml, por lo que se llenara con 5.6 ml de NaOH

2.    Con un palillo aplicador se agrega las heces hasta elevar el nivel del líquido a 60 ml. En el tubo cónico a 6.0 ml

3.    Se añaden de 5 a 10 cuentas de vidrio, se tapa con firmeza y se agita de arriba abajo hasta que las heces se desmoronen por completo.

4.    Cuando las heces están disueltas por completo, se agita el tubo un minuto. Los huevos, quistes y restos se precipitan en cuanto cesa la agitación, y de inmediato se toman 0.075 ml del centro de la suspensión (o una gota grande tomada con el aplicador)  y se colocan en un portaobjetos.

5.    Se coloca un cubreobjetos.
6.    Con aumento de 40X se cuentan los huevos de toda la preparación.

OBSERVACIONES

Frotis, 10x

Sobresale una fibra de residuo vegetal en todo el campo. Junto a la mancha café, se observa lo que probablemente es un quiste de E. histolytica.

 

Frotis, 10x

Se distinguen en estas dos imágenes diversos residuos de fibras vegetales. En la primera tiene forma de una pequeña red. La segunda es de color azul.

Frotis, 40x

Al acercar el primer campo, se descartó la presencia del quiste y se determinó que era un residuo vegetal

Frotis, 40x

A las 12 dos grandes placas de celulosa vegetal y debajo de ellas una gran cantidad de cristales de ácidos grasos.

Frotis, 40x

A las 7 se distinguen dos fibras espirales de restos de comida.

RESULTADOS

En esta práctica, el resultado para huevecillos de parásitos resulto negativo.

Se encontraron varias fibras vegetales, restos de comida, celulosa y cristales de ácido graso.

Sin embargo, en el caso de resultar positivo, y de llevar a cabo con los 56 ml de NaOH se efectúan dos cuentas utilizando partes separadas de 0.075ml de la suspensión (total= 0.15ml) y se realizan los siguientes cálculos:

1.    La disolución fecal original es de 1 en 15 (4ml/60ml). Como se contaron los huevos en un volumen total de 0.15 ml, el número total de éstos en 1ml de heces se encuentran al multiplicar la cuenta total por 100 (1/5 x 0.15 x 100=1).

2.    Suponiendo que el promedio de una persona rebasa los 100 g de heces por día, es posible calcular el número de huevos por día multiplicando el resultado por 100 (o la cuenta de la suspensión original por 10 000).

3.    Para determinar el número de parásitos hembras presentes, se divide el número diario de huevecillos que hay en las heces entre el número promedio de huevecillos de las distintas hembras de helmintos parásitos (ver más adelante en conclusión)

4.    Se encuentra la cantidad total de parásitos al multiplicar por dos los resultados encontrados en el paso tres, ya que se supone que en cualquier infestación hay un parásito macho por cada parásito hembra.

CONCLUSIÓN

La técnica de Stoll es un método de dilución en el cual se suspenden 4 ml de materia fecal se suspenden en 60 ml de NaOH 0.1 N y se cuenta el número de huevecillos en un volumen estándar de suspensión.

HUEVECILLO DE NECATOR AMERICANUS

Una de las grandes ventajas de este procedimiento, es que no es indispensable tener el equipo de Stoll completo, pues si no se dispone de este, se puede realizar en equipo de laboratorio convencional.

HUEVECILLO DE ASCARIS

El concepto básico de este procedimiento es contar los huevecillos  en un volumen conocido de concentración conocida de heces en NaOH 0.1 N y calcular el número por gramo de heces.

El conteo de los huevecillos se basa en el principio de que por cada macho hay una hembra, y se usan para calcular los siguientes parámetros:

Hembra de la especie Necator americanus: 7000 huevos/día

Hembra de la especie Ascaris lumbricoides: 200000 huevos /día

HUEVECILLO DE TRCHURIS TRICHUIRA 

Hembra de la especie Trichuris trichuira: 7500 huevo/día

Algunos laboratoristas creen que se deben utilizar los factores de correlación de la consistencia de las heces para obtener resultados más exactos. Para esto, se debe multiplicar el número que se obtiene en el paso uno por el factor apropiado.

Heces formadas= 1

Blandas formadas= 1.5

Blandas diarreicas= 3

Fluidas diarreicas= 4

Muy líquidas= 5

Estos factores dependen de la cantidad de agua que las muestras contengan. Si se encuentran quistes únicamente se reportan, sin cuantificarse.

En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo (trofozoíto o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

Puede ser necesario que las heces duras se dejen reposar con NaOH durante varias horas o durante una noche en el refrigerador para que se ablanden.

Sobre los resultados tienen influencia muchas variables, como dieta, mala digestión, los ciclos de producción de huevos y la consistencia de las heces

Fuentes consultadas:

·         Manual de laboratorio de parasitología, documento formato pdf, consultado el día 28 de septiembre en http://es.scribd.com/doc/5275620/MANUAL-DE-LABORATORIO-DE-PARASITOLOGIA

·         Brown, H. W. Parasitología Clínica Edit. Interamericana. México, 1985. Pp. 339-340

• Técnica de Stoll, consultado el día 28 de septiembre en http://usuarios.multimania.es/paraelsa/manual04/practica-8.htm

PRACTICA No.6: "COPROPARASITOSCÓPICO: MÉTODO DE CONCENTRACION POR FLOTACION DE WILLIS"

COPROPARASITOSCÓPICO: MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR FLOTACIÓN DE WILLIS

Esta práctica se llevó a cabo el día jueves 22 de septiembre 2011, en las instalaciones del laboratorio para prácticas de análisis clínicos del CBTis 199, como parte del programa de 3º semestre para la preparación de la carrera de Laboratorista Clínico, en su subdivisión de técnicas parasitológicas.

OBJETIVO

 Aprender a realizar la técnica por flotación de Willis, para la búsqueda de quistes y huevos que puedan quedar en la superficie del líquido.

FUNDAMENTO

Este método fue descrito por primera vez en 1921 por Willis. Es recomendado especialmente para la investigación de geohelmintos. Consiste en  preparar el material fecal con solución saturada de NaCl (cloruro de sodio).

Los huevos y quistes de peso específico menor que la solución saturada de cloruro de sodio tienden a subir y adherirse a la superficie que este en contacto con la del líquido.

En el laboratorio por lo regular, se usa como superficie de contacto un cubreobjetos o un portaobjetos.

Este método es de alta sensibilidad en el diagnóstico de huevos livianos de helmintos y quistes de protozoarios  como:

·         Entamoeba histolytica
·         Entamoeba coli
·         Trichomona tenax
·         Ancylostoma duodenale
·         Necátor americanus
·         H. nana.

No se recomienda para la búsqueda de huevos pesados ni de larvas.

MATERIAL: v  Vaso de precipitados v  Embudo v  Gasa v  Tubo de ensayo v  Portaobjetos v  Cubreobjetos v  Gradilla v  Pipeta con propipeta v  Abatelenguas

SUSTANCIAS:

Ø  Solución saturada de NaCl
Ø  Solución de yodo-lugol
Ø  Muestra biológica: heces fecales frescas

PROCEDIMIENTO

1.    Tomar aproximadamente 1 gr de heces fecales con un abatelenguas

2.    Colocar la muestra en un vaso de precipitados y mezclar con 10 ml de solución saturada de cloruro de sodio.

3.    Filtrar la mezcla en un tubo de ensayo, usando la gasa y el embudo.

4.    Completar con solución saturada hasta el borde del tubo

            

5.    Colocar un portaobjetos sobre el tubo, de manera que el líquido haga contacto con el portaobjetos

6.    Se coloca en la gradilla y se espera de 5 a 10 minutos

7.    Retirar el portaobjetos cuidando de no tirar el material que haya quedado en él y colocar una gota de lugol.

8.    Cubrir con un cubreobjetos y observar al microscopio con objetivos 10x y 40x.

OBSERVACIONES

Frotis, 10x

Se encuentran regadas por todo el campo un gran número de bacterias. Destacan a las 6 pequeñas trazas de grasas

Frotis, 40x

Sobresale a la 1 un punto color café, pero que contenía 2 núcleos: sin duda alguna es un quiste de Entamoeba histolytica

Frotis, 40x

Desplazándose por el campo, se encontraron 2 quistes más de Entamoeba histolytica, a la una y a las dos. Ambos contenían 4 núcleos.

RESULTADOS

El resultado para huevecillos de parásitos resulto negativo. Sin embargo se encontraron 3 quistes de Entamoeba histolytica. Esto quiere decir que el huésped probablemente tenga una amibiasis asintomática, o tal vez se enferme seguido del estómago, pero no de manera tan grave. Se necesitarían por lo menos otras dos muestras y hacer frotis directos de ellas para confirmar el diagnóstico de amibiasis.

 

Tampoco hay que menospreciar la gran cantidad de bacterias halladas, muy probablemente bacilos de Escherichia coli, una bacteria común en el tubo digestivo, que dependiendo su serotipo puede ser benigna o patógena, pero eso ya no corresponde a la parasitología.

  CONCLUSIÓN

  Esta técnica es una más de los métodos de concentración por medio de flotación, y es capaz de concentrar prácticamente todos los huevos de nematodos.

 

Es altamente recomendado  para el diagnóstico de ancylostomideos y basa su capacidad diagnostica en el menor peso específico de los huevos contenidos en la solución saturada de NaCl, la cual posee una densidad de 1.200, lo que permite la flotación de los huevecillos y quistes de estos, cuyo peso es menor a este parámetro.

 Sin embargo, el método de Willis tiene la desventaja de que resulta ser menos sensible para el diagnóstico de T. trichiura y A. lumbricoides, pues sus huevecillos no siempre tienen una densidad menor a 1.200

  

Fuentes consultadas:

·         Directo, Willis, Kato, Kato cuantitativo, Faust, coloración rápida. Morfología de cestodos y helmintología, artículo consultado el día 21 de septiembre en http://usuarios.multimania.es/paraelsa/manual04/practica-6.htm

·         Análisis coprológico parasitario, documento en formato pdf consultado el día 21 de septiembre en http://personal.us.es/cariza/web/para/practicas/cuadernos/analisis-coprologico-parasitario.pdf

·         Método de Willis, consultado el día 21 de septiembre en http://www.buenastareas.com/ensayos/Metodo-De-Willis/40633.html

PRÁCTICA No.3: "COPROPARASITOSCÓPICO: MÉTODO DE CONCENTRACIÓN-FLOTACIÓN DE FAUST"

COPROPARASITOSCÓPICO: MÉTODO DE CONCENTRACIÓN-FLOTACIÓN DE FAUST

Esta práctica se llevó a cabo el día jueves 8 de septiembre 2011, en las instalaciones del laboratorio para prácticas de análisis clínicos del CBTis 199, como parte del programa de 3º semestre para la preparación de la carrera de Laboratorista Clínico, en su subdivisión de técnicas parasitológicas

FUNDAMENTO

En este método se utiliza solución de Zn, cuya densidad específica es de 1.180 (33%), que conforma un medio de densidad más alta que la de los huevos:

Necátor 1.055

Tricocéfalo 1.150

Áscaris fértil 1.110

Y facilita que los huevos livianos de estos helmintos, con menor peso específico que la solución, se concentren y floten.

La concentración adecuada aconsejada es la que usa como reactivo  una solución acuosa  de sulfato de Zn al 33% con una densidad al 1.180. El agua utiliza diluye y lava materia fecal. El filtrado con gasa doblada y evita que los detritos gruesos traspasen las paredes, la centrifugación enriquece en delgada película la superficie del líquido centrifugado con los huevos livianos de algunos helmintos.

MATERIAL: v  Portaobjetos v  Cubreobjetos v  Vaso de precipitados v  Tubos de ensayo v  Asa v  Embudo v  Gasas v  Aplicadores de madera v  Centrifuga v  Microscopio v  Abatelenguas

SUSTANCIAS:

Ø  Solución acuosa de sulfato de zinc

Ø  Solución de yodo
Ø  Muestra biológica: heces fecales frescas

PROCEDIMIENTO

1.    Tomar con el abatelenguas una porción de materia fecal para disolver en 10 partes de agua destilada

2.    Filtrar la suspensión a través de una gasa doblada en cuatro, sobre un tubo de ensayo, ayudándose con un embudo pequeño

3.    Centrifugar el filtrado a 2500 rpm por 1 minuto

4.    Decantar el líquido sobrenadante y completar con agua hasta igualar la medida anterior, centrifugar nuevamente. Resuspender el sedimento

5.    Repetir el procedimiento 2 veces hasta que el líquido sobrenadante esté listo

6.    Decantar nuevamente el líquido sobrenadante remplazándolo por igual cantidad de solución de sulfato de zinc al 33%. Mezclar bien la solución con el sedimento.

7.    Centrifugar durante 1 minuto a 1500 rpm

8.    Tomar con el asa de 3-4 gotas de las partículas que flotan en la superficie del líquido.

9.    Colocarlos en un portaobjetos y mezclar con 1-2 gotas de yodo-lugol

10. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio.

OBSERVACIONES

Muestra 1: Frotis teñido, 10x

Se distingue a la 1 y en el centro dos estructuras de forma irregular que corresponden a residuos de grasas

Muestra 1: Frotis teñido, 10x

Se distinguen en este par de imágenes nuevamente grasas y el de la derecha aparece un residuo vegetal, ambos son residuos de alimentos

Muestra 1: Frotis teñido, 10x

Sobresale a partir de las 10 una fibra vegetal, que tomó una coloración roja gracias al yodo y la 1 se encuentran trozos de grasas y un jabón

Muestra 1: Frotis teñido, 10x

A las 11 se observan fibras de tejido conectivo y a las 4 cuatro más residuos vegetales

RESULTADOS

Como puede verse, el resultado para huevecillos de parásitos resulto negativo.

Lo que se encontró en mayor cantidad fueron restos de comida, fibras de tejido, grasas con mucha frecuencia y jabones, quistes o huevecillos como se esperaba.

CONCLUSIONES

Las técnicas de flotación, sedimentación y conteo son algunas de los métodos  utilizados para la determinación de parásitos intestinales como parte del diagnóstico de protozoarios, trematodos, cestodos, nematodos y ocasionalmente, algunos artrópodos.

Uno de los más conocidos y usados es el método de Faust o de flotación en sulfato de zinc (ZnSO₄.)

Es usado para detectar parásitos del tubo digestivo. Las especies que parasitan al hombre son Necator americanus, Ancylostoma duodenale y, en menor medida, Ancylostoma ceylonicum.

Los anquilostomas cortan la pared intestinal del hospedador, alimentándose de la sangre de éste. Los adultos se aparean dentro del intestino del huésped, y la hembra produce miles de huevos que salen con las heces. La infección se realiza por la penetración de la larva a través de la piel o por ingesta de aguas contaminadas con materia fecal

Este método aprovecha la densidad. Así, quedaron depositados los huevecillos en el fondo de la muestra, porque su densidad es mayor al agua.  El ZnSO₄ hace que los huevecillos se eleven a la superficie, aprovechando el mismo principio de densidad.

La función de la centrifuga en esta práctica fue de suma importancia, puesto que utiliza la fuerza centrípeta para separar sustancias de diferentes densidades.

Se puede predecir el resultado de la positividad de manera macroscópica cuando en el tubo de ensayo con la solución de sulfato de zinc, la cantidad y el tamaño de las partículas es grande, se puede decir que sospechosamente será positivo.

De lo contrario, si las partículas son muy pequeñas, lo más probable es que sea negativo.

El método de Faust es el más adecuado para determinar la existencia de agentes infecciosos no solo en las heces fecales, sino también en las aguas residuales o negras.

Por eso es importante no beber agua sucia y lavarse las manos antes de comer y después de ir al baño.



Fuentes consultadas:

·         Técnicas coproparasitoscópicas, consultado el día 9 de septiembre 2011 en http://html.rincondelvago.com/parasitologia_5.html

·         Brown, H. W. Parasitología Clínica. Edit. Interamericana. México, 1985. Pp. 338-339